Principe TIRF

La microscopie de fluorescence par réflexion totale interne ou TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence microscopy) ou microscopie à onde évanescente est très appropriée pour les études de localisation et de dynamique des molécules de la membrane plasmique.

Quand le faisceau d’excitation passe d’un milieu d’indice de réfraction n1 (lamelle en verre n1 =1.51)  à un milieu d’indice de réfraction n2 inférieur (pour l’eau n2 =1.33), il existe un angle incident critique, au-dessus duquel le faisceau laser est complètement réfléchi. En microscopie TIRF l’illumination se fait avec un angle donnant une réflexion totale qui peut être obtenu de 2 façons :

1)    le faisceau et la détection sont séparés. Le faisceau d’excitation passe par un prisme et excite l’échantillon en réflexion totale puis la fluorescence est récupérée par l’objectif.
2)    le faisceau d’excitation passe par un objectif de grande ouverture numérique avec un angle supérieur à l’angle critique. La fluorescence est ensuite récupérée par le même objectif.

L’avantage de la microscopie TIRF est l’excitation sélective de l’échantillon, car seule une zone de quelques dizaines de nanomètres est excitée au-dessus de la lamelle (interface des 2 milieux). Le champ d’excitation TIRF décroit exponentiellement avec la distance de la lamelle, où les cellules sont cultivées. La fluorescence provenant des autres niveaux est alors éliminée (pas d’excitation au dessus de ≈100nm) et le rapport signal sur bruit est élevé, pour les marquages proches de la surface.

Tutoriel

Tutoriel vidéo (en Anglais) sur ibiology.org.

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