Cytomètre en Flux en images (ImageStream)

Principe


Selon le principe de la cytométrie conventionnelle, les cellules (ou éléments en suspension) sont soumises à une pression, subissent le phénomène de focalisation hydrodynamique et s’alignent pour être analysées une à une.

Les signaux émis par la cellule lorsqu’elle passe devant le faisceau laser sont collectés par un microscope qui les dirige vers un système optique de décomposition spectrale. Chacune des bandes spectrales est ensuite orientée vers une caméra qui, classiquement, convertit les photons en photocharges dans une matrice de pixels. Chaque pixel est digitalisé à une résolution de 12 bits dans une échelle allant de 0 à 4096.
Notre système est équipé de 2 caméras qui sont synchronisées sur la vitesse du flux grâce à des “Speedbeads” (billes de 1 micron, Amnis) éclairées par le laser à leds à 830 nm. Un détecteur de vitesse et un autofocus synchronisent les 2 caméras pendant le processus d’acquisition des images. Chaque pixel est analysé en temps réel par un algorithme qui calcule les paramètres morphométriques et photométriques.

Le logiciel IDEAS d’analyse des données et de retraitement des images est spécifique du système. Il permet de quantifier statistiquement des centaines de paramètres sur plusieurs milliers de cellules.

Equipement disponible
 

  • Un cytomètre en flux en images ImageStreamX (Amnis part of EMD Millipore, Proteigene) équipé de :

- un laser Brighfield permettant une mesure de la taille de la cellule, de sa structure ainsi que de sa morphologie,

- un laser Darkfield 785 nm permettant de localiser et de quantifier la lumière réfléchie par les structures sub-cellulaires (Side Scatter),

- quatre lasers permettant de quantifier et de localiser des biomolécules d’intérêt dans chaque canal de détection :

un laser 405 nm qui permet l’acquisition des bandes spectrales allant de 430 à 800 nm  réparties dans 5 canaux différents,
un laser 488nm qui permet l’acquisition des bandes spectrales allant de 480 à 800 nm  réparties dans 5 canaux différents,
un laser 560 nm qui permet l’acquisition des bandes spectrales allant de 560 à 800 nm  réparties dans 4 canaux différents,
un laser 658 nm qui permet l’acquisition des bandes spectrales allant de 660 à 800 nm  réparties dans 2 canaux différents.

Si besoin, l’image « Darkfield » peut être substituée par une image de fluorescence supplémentaire permettant l’acquisition de la bande spectrale allant de 745 à 800 nm.

-trois lentilles pour des grossissements 20x, 40x et 60x

L’ImageStreamX permet de collecter simultanément jusqu’à 12 images de chaque cellule dans un flux à l’aide de deux caméras CCD, assurant que les données représentent une prise de vue de chaque cellule à un instant donné.
Il peut imager, à une digitalisation de 12 bits, jusqu’à :

- 2000 cellules/s avec une résolution de 1 µm avec l’objectif 20x,
- 1000 cellules/s avec une résolution de 0,5 µm avec l’objectif 40x et,
- 600 cellules/s avec une résolution de 0,33 µm avec l’objectif 60x.

Un module d’extension de champ (EDF) permet une projection de l’image avec un champ focal de 16 µm. Il est utilisé quand il est essentiel d’avoir toute la cellule dans un focus optimisé (fish spot par ex).

 

 

Applications


Le cytomètre en flux en images combine la puissance quantitative d’un cytomètre en flux conventionnel et l'analyse précise d’un microscope.

Les applications spécifiques à l’ImagestreamX sont multiples :
- analyse de morphologie,
- internalisation,
- signalisation cellulaire et translocation moléculaire,
- co-localisation, interactions cellulaires, cycle cellulaire, apoptose,
- comptage de spots,
- autophagie et mort cellulaire,
- nombreuses applications émergentes.

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