Cytomètres en flux conventionnels

Principe

La solution de cellules (ou d’éléments en suspension) est entrainée dans une buse de forme conique terminée par un petit orifice parfaitement calibré (50 à 250 microns selon la buse). Cette buse contient également un liquide de gaine, généralement du PBS, soumis à une pression plus ou moins élevée qui crée le défilement rapide et centré des cellules dans la veine liquide (focalisation hydrodynamique). En passant en file indienne devant le(s) faisceau(x) laser, les cellules sont analysées une à une.
Les signaux lumineux émis par chacune des cellules sont collectés et acheminés vers des détecteurs via des miroirs dichroïques et des filtres :
 - la lumière diffusée aux petits angles (Forward Scatter, FSC) est collectée dans l’axe du faisceau du laser. Elle correspond à la diffraction et renseigne sur la taille des particules,
- la lumière diffusée aux grands angles (Side Scatter, SSC) est collectée à 90° par rapport au faisceau laser. Il s’agit d’un mélange de diffusion, de réflexion et de réfraction qui renseigne sur la structure interne de la cellule,
- la fluorescence est collectée à 90° par rapport au faisceau lumineux. Elle peut être une autofluorescence (lumière émise par la cellule elle-même), ou résulter d’un marquage par un ou plusieurs fluorochromes.

Dans le cas du tri, un quartz piézo-électrique crée une vibration sur la buse, produisant ainsi une ondulation de la veine liquide qui va se briser en gouttelettes.
Lorsque la cellule analysée correspond à une cellule d’intérêt (classée dans une fenêtre de tri), une charge électrique est appliquée sur l’ensemble de la veine liquide au moment où cette cellule se situe à l’extrémité du jet. La gouttelette se détache alors du jet en conservant l’excès de charge (+ ou -). Puis elle est déviée en fonction de cette charge en passant entre deux plaques à haute tension pour être collectée dans un tube ou dans une plaque multi-puits.
En jouant sur l’intensité de la charge électrique appliquée à l’ensemble du jet, il est possible de trier simultanément une à plusieurs populations en fonction des trieurs.

Equipement disponible

  • Un analyseur CyAn ADP 9C (DakoCytomation racheté par Beckman Coulter).

C’est un cytomètre en flux haute vitesse qui permet d’analyser jusqu'à  50 000 cellules/seconde. Il est équipé de 3 lasers :
- 405 nm : filtres Band Pass 430/20 et 450/50,
- 488 nm : filtres Band Pass 530/40, 575/25, 613/10, 680/30 et 750 Long Pass,
- 635 nm : filtre Band Pass 665/20 et 750 Long Pass.
Il permet l'analyse simultanée des 2 paramètres taille/granulosité (FSC/SSC) et de 9 signaux de fluorescence.

  • Un analyseur-trieur INFLUX 500 (Cytopeia racheté par BD BioSciences)

Il est équipé de 5 lasers :
355 nm : filtres band pass 406/50, 528/38, et 460/50, 670/30,
405 nm : filtres band pass 460/50, 550/50 et 610/20,
488 nm : filtres band pass  528/38, 579/34, 610/20 et 670/30,
561 nm : filtres band pass 579/34 et 624/40,
635 nm : filtre band pass 670/30 et long pass 750.

Le trieur Influx 500 peut analyser simultanément jusqu'à  15 paramètres (taille, granulosité et 13 signaux de fluorescence) et effectuer le tri. Au cours de l'analyse, les éléments peuvent être séparés physiquement en 1, 2, 3 et jusqu'à 4 sous-populations simultanément selon les propriétés mesurées. Un système automatique est disponible pour distribuer les cellules triées dans des plaques de culture 6 à 96 puits (clonage) en conditions stériles.

Applications

Toutes les techniques de cytométrie en flux sont réalisables dans la mesure où les fluorochromes utilisés sont compatibles avec les lasers et la configuration des bancs optiques de l’instrument.

Les principales applications concernent :
- analyse des constituants cellulaires (ADN, ARN, protéines, expression d'antigènes membranaires et/ou intracellulaires,…),
- analyse de fonctions cellulaires (activation, production de cytokines, variation du potentiel membranaire ou mitochondrial, apoptose, activités enzymatiques…),
- mise en évidence de cellules transfectées (Lac Z, EGFP, EYFP, DsRED…).

Toutes ces mesures peuvent être associées entre elles (ex protéines/cycle), et accompagnées d’un tri des cellules sur la base des propriétés analysées.
 

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