Multi-photonique

La microscopie à excitation multi-photon est une alternative à la microscopie confocale qui apporte certains avantages notamment dans le cas d’observation d’échantillons épais et vivants. Elle est particulièrement adaptée à l’étude de tissus intacts (coupe de cerveau, embryons, organes entiers) sur une longue durée.

Principe

Tout comme la microscopie confocale, la microscopie multi-photon (ou bi-photon) utilise un laser pulsé pour exciter un marqueur fluorescent d'un échantillon et un détecteur pour l'acquisition de la lumière d'émission.
Cependant, le laser utilisé en microscopie deux-photon permet l'excitation d'un marqueur fluorescent par son absorption simultanée de l'énergie de deux photons au lieu d'un seul en microscopie conventionnelle. Le laser est pulsé afin d'envoyer des paquets de photons fortement concentrés (fortes puissances crêtes)  et d'augmenter les chances d'absorption simultanée des photons. Les deux photons absorbés quasi simultanément le sont uniquement au point focal ou la lumière est la plus concentrée et doivent être de longueur d'onde proche. Les deux photons absorbés sont de faible énergie et ont le même effet qu'un photon absorbé de plus forte énergie.
Ces caractéristiques mènent à plusieurs avantages :
- Les photons étant de plus faible énergie, leur longueur d'onde est plus grande (proche infrarouge pour les fluorophores absorbant dans le visible). Les grandes longueurs d'onde utilisées sont moins dommageables pour l'échantillon et pénètrent d'avantage dans les tissus que ceux de plus courte longueur d'onde.
- L'absorption de l'énergie de plusieurs photons sera confinée à la région focale. La fluorescence est donc émise uniquement à partir de cette région, il n'y a pas de lumière provenant d'en dehors du focus qui pourrait rendre l'image floue. Cela crée les conditions d'une image confocale ne nécessitant pas de pinhole à l'émission.
- Les processus photodynamiques tels que la destruction irréversible des molécules fluorescentes ou la production de radicaux libres ne se produisent qu'à la région focale. Minimisant souvent l'invasivité de la microscopie bi-photonique comparativement à la microscopie confocale mono-photon.
- La longueur d'onde d'excitation bi-photon est typiquement deux fois la longueur d'onde de l'excitation mono-photon. La séparation entre les deux spectres d'excitation et d'émission assure que la lumière d'excitation sera bien filtrée et que la lumière émise sera détectée.

Equipements disponibles

Lasers femtosecond :
Insight Spectra Physics (690-1300nm), puissance moyenne 1W partout
MaiTai Spectra Physics, 690-1060nm, puissance max 3W
Le laser Mai-Tai peut être utilisé indépendamment du laser Insight, comme un laser d’ablation, avec la possibilité d’ablater et de faire l’imagerie en même temps, en utilisant 2 scanners indépendants.

Balayage :
2 scanners galvanométriques pour le bras de l’imagerie et pour le bras de l’ablation, 1 scanner résonant pour l’imagerie
Objectifs : Zeiss 20x 1.0 (eau), Zeiss 40x 1.3 (eau), Zeiss 63x 1.3 (eau)

Emission :
Détection non déscannée en réflexion 4 PMTs GaAsp
405/15 SHG, 460/60 DAPI, 525/50 GFP, 560/40, 620/60, 670/30, 610/10 THG
Détection non descanée en reflexion 2 PMTs GaAsp couplés au scanner résonant

Innovation and specificity of the microscope:

  • 2 IR pulsed lasers (Insight 700-1300nm and MaiTai 700-1060nm)
  • 4 GaAsp detectors in reflection – 2 GaAsp detecors for resonant scanner
  • Possibility of ablating and imaging at the same time (with 2 lasers – 2 different excitation paths-scanners)
  • Classic or resonant scanner

Applications:

  • Label-free imaging (SHG-THG)
  • In depth imaging of brain slices/tissues/organisms
  • Embryon imaging and development
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