Illumination structurée (SIM)

Principe

La limite de la résolution optique pour distinguer deux molécules très proches est définie par la distance de Rayleigh (0,61λ/NA). Avec la microscopie classique on ne peut pas distinguer deux molécules situées à une distance inférieure à cette distance Rayleigh. La microscopie SIM (Structured Illuminated Microscopy) permet d’obtenir un gain de résolution d’un facteur 2 sur toutes les directions, donc d’un facteur 8 en volume.

La microscopie SIM est basée sur l’utilisation d’une illumination structurée (pattern sinusoïdale) pour exciter les échantillons fluorescents.  Le pattern d’illumination est superposé avec le pattern des structures dans l’échantillon et leur interférence produit un troisième pattern caractéristique, les franges Moiré (figure 1).

Les franges Moiré ont une fréquence spatiale plus basse que les structures originales de l’échantillon et donc peuvent être transmises par la lentille de l’objective et on peut avoir leur image. Les 3 patterns sont indépendants et peuvent être utilisés pour connaître les informations super-résolues de l’échantillon, c’est à dire récupérer des fréquences hautes, qui normalement ne peuvent pas passer par l’objectif du microscope. Afin d’avoir un gain de la résolution isotrope, on récupère pour chaque plan des images pour 3 orientations différents de la grille et pour 5 phases différentes du pattern d’illumination.
Après avoir récupéré les images pour des orientations et des phases différentes de la grille avec le logiciel ZEN (Zeiss) nous pouvons faire la reconstruction des images (en passant par les Transformations de Fourier) et construire l’image super-résolue de l’échantillon (gain 3D en résolution d’un facteur 2).
Des images super-résolues en trois dimensions sont possibles. Il n’y a pas de restriction au choix des fluorophores utilisés.

Equipement Disponible

La plateforme ImagoSeine dispose d’un microscope ELYRA PS.1 (Zeiss). Le laser d’excitation passe par une grille, qui crée l’illumination structurée. Nous disposons de quatre lasers d’excitation (405, 488, 561, 642nm) et quatre grilles différentes sont utilisées (avec un pas de grille différent) pour chaque longueur d’onde d’excitation. Nous disposons de 2 objectifs pour le SIM, un objectif 63x Zeiss à immersion, ON 1.4 et un 100x, ON 1.46. Le 100x permet de combiner l’imagerie SIM et TIRF, pour des marquages membranaires ou proches de la surface de la lamelle.
La détection se fait avec une camera EMCCD Andor, iXon 885 (1004x1002, taille de pixel 8μm, QE=65%).

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