3D PALM/STORM

Principe

La limite de la résolution optique pour distinguer deux molécules très proches est définie par la distance de Rayleigh (0,61λ/NA). Avec la microscopie classique on ne peut pas distinguer deux molécules situées à une distance inférieur à cette distance Rayleigh.

La microscopie à molécule unique permet la détection d’une molécule unique marquée avec un fluorophore et ensuite la localisation du centre de sa tache de diffraction (fit gaussien). La précision de la localisation dépend principalement du nombre de photons détectés. Cette technique nous permet de localiser la position des molécules avec une précision de l’ordre de 10-20nm, inférieure à la limite de résolution optique. Par contre, si plusieurs molécules se trouvent dans la même tache de diffraction la super-localisation de leur position n’est pas possible.
Les techniques de PALM et de STORM reposent sur un principe semblable au pointillisme. Pour chaque acquisition, une fraction des molécules fluorescentes est utilisée, afin de distinguer chaque molécule émettrice. L’accumulation des acquisitions permet la reconstitution d’une image super-résolue (figure 1).

PALM : PhotoActivated Localization Microscopy
Le développement de nouvelles sondes fluorescentes (milieu des années 2000) a ouvert la voie à de nouvelles stratégies de microscopie de fluorescence. L’utilisation des protéines photoactivables et photoconvertibles ont permis le développement de la microscopie PALM (PA-GFP, PA-tagRFP, PA-mCherry, mEos2, Dendra2, etc). C’est une technique basée sur la détection des molécules uniques. A l’aide de la lumière ultraviolette (405nm), les molécules photo-activables vont devenir fluorescentes ou les molécules photoconvertibles vont changer le spectre d’émission. En utilisant ce type de molécules avec 2 faisceaux laser (une pour la photoactivation ou photoconversion et l’autre pour la lecture), on excite chaque fois un faible nombre des molécules, on les détecte (=localisation avec une précision au dessous de la limite de diffraction), on les photoblanchit et ensuite on excite et détecte d’autres qui seront photoactivées ou photconverties par le faisceau UV. L’image finale consiste en la somme de toutes les images détectées et est une image super-résolue.  Avec cette technique et l’utilisation de protéines fluorescentes, on peut effectuer des expériences avec des cellules vivantes.


STORM : STochastic Optical Reconstruction Microscopy
Des sondes organiques (paire Cy3-Cy5) sont utilisées en microscopie de reconstitution optique stochastique (STORM). Le dSTORM (direct STORM) est une technique qui utilise un ou plusieurs marqueurs organiques et un tampon ayant des propriétés oxydo-réductrices.  Avec ce tampon et un faisceau dans l’UV on peut contrôler le taux de clignotement des marqueurs, afin d’imager chaque fois une densité faible des molécules, pour avoir ensuite une localisation avec une précision au-dessous de la limite de résolution.
Les marqueurs organiques sont couplés aux anticorps, donc les cellules sont perméabilisées pour réaliser les marquages intracellulaires. Le choix pour faire des expériences avec des cellules vivantes est très limité. Par contre, le signal  (et donc la précision sur la localisation) est élevé, grâce à l’utilisation des molécules organiques. En plus, le choix des molécules est large (la plupart des Alexa Fluor et ATTO) et il est possible d’utiliser plusieurs fluorophores, pour des expériences à 2 ou 3 couleurs.

Equipement disponible

La plateforme dispose d'un microscope ELYRA de Zeiss. L'excitation peut se faire en mode TIRF avec un objectif à immersion Zeiss 100x ON 1.46, ou avec un objectif 100x ON 1.56 (avec une huile d'immersion spécial pour ce type d'objectif). Le système est équipé de quatre faisceaux laser:405nm (puissance maximale 50mW), 488nm (Pmax = 100mW), 561nm (Pmax = 100mW), 642nm (Pmax = 100mW).

La détection se fait avec une camera ultra-sensible EMCCD, iXon 897 (512x512, taille de pixel 16μm, QE=90%).

Le microscope est équipé d'une fonction 3D, afin de faire l'imagerie PALM/STORM dans un range en z de 1,5μm.

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